เทคโนโลยี PCR

เทคโนโลยี PCR ต้องมีไพรเมอร์ที่สังเคราะห์ได้อย่างเหมาะสมและสกัด DNA ตัวอย่าง จากนั้นจึงทำการหมุนเวียนความร้อนโดยอัตโนมัติ และดำเนินการระบุและวิเคราะห์ผลิตภัณฑ์ในที่สุด ในปัจจุบัน การออกแบบและการสังเคราะห์ไพรเมอร์สามารถทำได้ในสถาบันวิจัย สถาบัน และคลินิกเพียงไม่กี่แห่งที่มีจุดแข็งทางเทคนิคที่แข็งแกร่งเท่านั้น แอปพลิเคชันจำเป็นต้องซื้อชุดตรวจจับ PCR เพื่อเริ่มทำงานเท่านั้น มีปัจจัยที่มีอิทธิพลมากมายในวงจรความร้อนอัตโนมัติ PCR สำหรับตัวอย่าง DNA ที่แตกต่างกัน ปริมาณของส่วนประกอบต่างๆ ที่เติมในปฏิกิริยา PCR และพารามิเตอร์ของวัฏจักรอุณหภูมินั้นไม่สอดคล้องกัน

ตอนนี้มีการแนะนำปัจจัยที่มีอิทธิพลหลักหลายประการดังนี้

หนึ่ง พารามิเตอร์วัฏจักรอุณหภูมิ

ในวัฏจักรความร้อนอัตโนมัติ PCR ปัจจัยที่สำคัญที่สุดคืออุณหภูมิของการเปลี่ยนสภาพและการหลอม ดังที่แสดงในตัวอย่างการทำงาน เงื่อนไขของการเปลี่ยนสภาพ การหลอม และการขยายคือ: 94℃60s, 37℃60s, 72℃120s รวมเป็น 25~30 A รอบ ส่วนขยายคือ 500bp ที่นี่ควรคำนวณเวลาของแต่ละขั้นตอนหลังจากที่ส่วนผสมของปฏิกิริยาถึงอุณหภูมิที่ต้องการ ในตัววงจรความร้อนอัตโนมัติ เวลาจากอุณหภูมิเดิมของส่วนผสมจนถึงอุณหภูมิที่ต้องการจะใช้เวลา 30-60 วินาที ความยาวของเวลาหน่วงนี้ขึ้นอยู่กับปัจจัยหลายประการ รวมถึงชนิดของท่อปฏิกิริยา ความหนาของผนัง ปริมาตรของส่วนผสมของปฏิกิริยา ความร้อน แหล่งที่มา (อ่างน้ำหรือบล็อกความร้อน) และความแตกต่างของอุณหภูมิระหว่างสองขั้นตอน ซึ่งควรมีให้เพียงพอเมื่อตั้งค่าวงจรความร้อน ให้ความสนใจและพิจารณา และควรทำการวัดจริงในเครื่องมือแต่ละชิ้น

การพิจารณาที่สำคัญอีกประการหนึ่งเกี่ยวกับเวลาของวงจรความร้อนคือระยะห่างระหว่างไพรเมอร์ทั้งสอง ยิ่งระยะทางไกลเท่าไร ก็ยิ่งใช้เวลาในการสังเคราะห์ความยาวของลำดับเป้าหมายนานขึ้นเท่านั้น เวลาตอบสนองที่ระบุข้างต้นขึ้นอยู่กับความยาวการสังเคราะห์ที่เหมาะสมที่ 500bp ลำดับเป้าหมายจะถูกวาดขึ้น นี่คือข้อมูลเบื้องต้นเกี่ยวกับการเลือกอุณหภูมิต่างๆ

1. อุณหภูมิ denaturation แม่แบบ อุณหภูมิ denaturation กำหนดอุณหภูมิที่ DNA สองเกลียวละลายในปฏิกิริยา PCR ถ้าอุณหภูมิไม่ถึงอุณหภูมิ denaturation จะไม่มีการสร้างแม่แบบ DNA แบบสายเดี่ยว และ PCR จะไม่เริ่มทำงาน อุณหภูมิการทำให้เสียสภาพต่ำหมายถึงการเสียสภาพที่ไม่สมบูรณ์ DNA แบบสองสาย มันจะทำการรีไฟแนนซ์อย่างรวดเร็วจึงทำให้ผลผลิตลดลง โดยทั่วไป 90 ～ 95 ℃ เมื่อตัวอย่างถึงอุณหภูมินี้แล้ว ควรทำให้เย็นลงอย่างรวดเร็วจนถึงอุณหภูมิการหลอม การเปลี่ยนสภาพของดีเอ็นเอใช้เวลาเพียงไม่กี่วินาที และไม่จำเป็นต้องใช้เวลานาน ตรงกันข้าม คุณควรพยายามอย่างเต็มที่ที่อุณหภูมิสูง ย่อให้สั้นลงเพื่อรักษากิจกรรมของ Taq DNA polymerase อุณหภูมิการเปลี่ยนสภาพสูงสุดหลังจากเติม Taq DNA polymerase ไม่ควรเกิน 95°C

2. อุณหภูมิการหลอมรองพื้น อุณหภูมิการหลอมจะกำหนดความจำเพาะและผลผลิตของ PCR; ถ้าอุณหภูมิสูง ความจำเพาะจะรุนแรง แต่ถ้าอุณหภูมิสูงเกินไป ไพรเมอร์จะไม่สามารถรวมเข้ากับแม่แบบได้อย่างแน่นหนา และประสิทธิภาพการขยายดีเอ็นเอจะลดลง อุณหภูมิต่ำ ผลผลิตสูง แต่ต่ำเกินไปอาจทำให้ไพรเมอร์และแม่แบบไม่ตรงกัน ผลิตภัณฑ์ที่ไม่เฉพาะเจาะจงเพิ่มขึ้น โดยทั่วไป ให้เริ่มต้นด้วยสภาวะปฏิกิริยา 37℃ ตั้งค่าชุดของปฏิกิริยาควบคุมเพื่อกำหนดอุณหภูมิการหลอมที่เหมาะสมที่สุดสำหรับปฏิกิริยาเฉพาะ นอกจากนี้ยังสามารถอนุมานตามเนื้อหา (G+C)% ของไพรเมอร์เพื่อทำความเข้าใจการทดสอบ จุดเริ่มต้นของการทดสอบทั่วไป อุณหภูมิการหลอม Ta (อุณหภูมิการหลอม) ต่ำกว่าอุณหภูมิหลอมเหลว 5℃ TTm (อุณหภูมิหลอมเหลว) ของไพรเมอร์ขยายเสียงซึ่งสามารถคำนวณได้ตามสูตร:

ตา = Tm-5℃= 4(G{{2}}C){{4}} 2(A+T) -5℃

ในหมู่พวกเขา A, T, G และ C แทนจำนวนฐานที่สอดคล้องกันตามลำดับ ตัวอย่างเช่น สำหรับไพรเมอร์ 20 เบส ถ้าเนื้อหาของ (G+C)% คือ 50% จุดเริ่มต้นของ Ta สามารถตั้งค่าได้ที่ 55°C ที่ความเข้มข้นของไพรเมอร์ทั่วไป (เช่น 0.2 ไมโครโมล/ลิตร) ปฏิกิริยาการหลอมจะเสร็จสิ้นภายในไม่กี่วินาที และไม่จำเป็นต้องอบอ่อนในระยะยาว

3. การเลือกอุณหภูมิการขยายไพรเมอร์ขึ้นอยู่กับอุณหภูมิที่เหมาะสมของ Taq DNA polymerase โดยทั่วไป 70～75℃ อัตรามาตรฐานของเอนไซม์ที่เร่งปฏิกิริยานิวคลีโอไทด์ที่ 72℃ สามารถสูงถึง 35～100 นิวคลีโอไทด์/วินาที ต่อนาที. สามารถขยายความยาวได้ 1kb และความเร็วจะขึ้นอยู่กับองค์ประกอบของสารละลายบัฟเฟอร์ ค่า pH ความเข้มข้นของเกลือ และลักษณะของเทมเพลต DNA หากชิ้นส่วนขยายสั้นกว่า 150bp สามารถละเว้นขั้นตอนการขยายได้ และมันจะกลายเป็นวัฏจักรอุณหภูมิคู่ เนื่องจาก Taq DNA พอลิเมอเรสเพียงพอที่จะทำให้การสังเคราะห์ลำดับสั้น ๆ เสร็จสมบูรณ์ที่อุณหภูมิการหลอม สำหรับแฟรกเมนต์ลำดับสั้น ๆ ระหว่าง 100 ถึง 300 bp จะใช้วงจรอุณหภูมิคู่ที่รวดเร็วและเรียบง่ายได้อย่างมีประสิทธิภาพ ในขณะนี้ อุณหภูมิการยืดของไพรเมอร์จะเท่ากับอุณหภูมิการอบอ่อน สำหรับชิ้นส่วน DNA ที่มีขนาดเกิน 1kb การควบคุมการขยายเวลาสามารถควบคุมได้ภายใน 1 ถึง 7 นาทีตามความยาวของชิ้นส่วน ในเวลาเดียวกัน ควรเติมเจลาตินหรือรีเอเจนต์ BSA ลงในบัฟเฟอร์ PCR เพื่อให้ Taq DNA polymerase ทำงานและเสถียรเป็นเวลานาน เพศ; กลีเซอรอล 15% -20% ช่วยขยายชิ้นส่วน DNA ประมาณ 2.5kb หรือยาวกว่านั้น

4. จำนวนรอบของ PCR ทั่วไปโดยทั่วไปคือ 25 ถึง 40 รอบ ข้อผิดพลาดทั่วไปคือจำนวนรอบมากเกินไป พื้นหลังที่ไม่เฉพาะเจาะจงนั้นร้ายแรง และความซับซ้อนก็เพิ่มขึ้น แน่นอนว่าจำนวนรอบของปฏิกิริยานั้นน้อยเกินไป และให้ผลผลิตต่ำ ดังนั้นจึงจำเป็นต้องตรวจสอบให้แน่ใจว่าได้ผลิตภัณฑ์มา ภายใต้สมมติฐานของอัตรา ควรลดจำนวนรอบให้น้อยที่สุด

หลังจากการขยายเสร็จสิ้น ตัวอย่างจะถูกทำให้เย็นและเก็บไว้ที่ 4°C

2. ไพรเมอร์ ไพรเมอร์ ดีไซน์

ในการขยายเทมเพลต DNA คุณต้องออกแบบไพรเมอร์โอลิโกนิวคลีโอไทด์สองตัวก่อน ไพรเมอร์ที่เรียกว่าจริง ๆ แล้วเป็นชิ้นส่วนโอลิโกนิวคลีโอไทด์สองชิ้นที่ประกอบกับลำดับดีเอ็นเอเป้าหมายที่จะขยาย ระยะห่างระหว่างไพรเมอร์ทั้งสองเป็นตัวกำหนดความยาวของชิ้นส่วนที่ขยาย , 5'ส่วนปลายของไพรเมอร์สองตัวกำหนดตำแหน่งของ 5'ส่วนปลายของผลิตภัณฑ์ขยาย จะเห็นได้ว่าไพรเมอร์เป็นกุญแจสำคัญในการกำหนดความยาว ตำแหน่ง และผลลัพธ์ของชิ้นส่วนที่ขยาย PCR และการออกแบบไพรเมอร์มีความสำคัญมากกว่า

เงื่อนไขที่จำเป็นสำหรับการออกแบบไพรเมอร์คือต้องทราบลำดับดีเอ็นเอเป้าหมายที่ประกอบกับไพรเมอร์ ลำดับระหว่างไพรเมอร์ทั้งสองไม่จำเป็นต้องชัดเจน ลำดับที่รู้จักทั้งสองลำดับโดยทั่วไปคือ 15-20 เบส ซึ่งสามารถสังเคราะห์ได้ด้วยเครื่องสังเคราะห์ดีเอ็นเอ สอดคล้องกับไพรเมอร์เสริมสองตัว นอกจากนี้ หลักการโดยทั่วไปที่ปฏิบัติตามในการออกแบบไพรเมอร์ ได้แก่:

1. ความยาวไพรเมอร์คำนวณตามสถิติ และความน่าจะเป็นที่ลำดับโอลิโกนิวคลีโอไทด์ประมาณ 17 เบสอาจปรากฏในจีโนมมนุษย์เพียงครั้งเดียว ดังนั้นความยาวไพรเมอร์โดยทั่วไปจะไม่น้อยกว่า 16 นิวคลีโอไทด์ และสูงสุดไม่เกิน 30 นิวคลีโอไทด์ และความยาวที่ดีที่สุดคือ 20-24 นิวคลีโอไทด์ โอลิโกนิวคลีโอไทด์แบบสั้นดังกล่าวจะไม่ก่อรูปลูกผสมที่เสถียรที่อุณหภูมิโพลีเมอไรเซชัน (ผ่าน 72°C) บางครั้งก็ได้ที่ 5' เพิ่มลำดับที่ไม่ใช่ส่วนเสริมของเทมเพลตในตอนท้าย เช่น การจำกัดไซต์ของเอ็นไซม์หรือโปรโมเตอร์ เพื่อทำให้การโคลนยีนสมบูรณ์และความต้องการพิเศษอื่นๆ ไพรเมอร์ 5' end biotin label หรือ fluorescent label สามารถใช้เพื่อวัตถุประสงค์ต่างๆ เช่น การตรวจหาจุลินทรีย์

บางครั้งไพรเมอร์ไม่ทำงาน' ไม่ทราบสาเหตุ คุณสามารถย้ายตำแหน่งเพื่อแก้ไขได้

2. องค์ประกอบของไพรเมอร์ที่มีเนื้อหา (G+C)% ควรมีความสม่ำเสมอ และพยายามหลีกเลี่ยงการมีพอลิเมอร์ที่เป็นเบสเดียวกัน เนื้อหา (G+C)% ในไพรเมอร์ทั้งสองควรใกล้เคียงกันมากที่สุด ในส่วนที่เป็นที่รู้จัก (G+C) % ควรอยู่ใกล้กับแฟรกเมนต์ที่จะขยาย โดยทั่วไป 40% ถึง 60% จะดีกว่า

3. ด้านในของไพรเมอร์ควรหลีกเลี่ยงการก่อตัวของโครงสร้างรองที่ชัดเจน โดยเฉพาะโครงสร้างกิ๊บ ตัวอย่างเช่น:

4. ไม่ควรมีการเติมเต็มระหว่างไพรเมอร์ทั้งสองระหว่างไพรเมอร์ โดยเฉพาะอย่างยิ่งที่ 3' ปลายไพรเมอร์ แม้ว่าจะไม่สามารถหลีกเลี่ยงได้ เบสเสริม 3'end ไม่ควรเกิน 2 เบส มิฉะนั้น จะสร้าง"primer dimer" หรือ"ไพรเมอร์ไดเมอร์" (ไพรเมอร์ไดเมอร์). ไพรเมอร์ที่เรียกว่าไพรเมอร์นั้นโดยพื้นฐานแล้วเป็นชิ้นส่วน DNA ที่มีเกลียวสองเส้นซึ่งเกิดขึ้นจากการขยายไพรเมอร์หนึ่งตัวในลำดับไพรเมอร์อื่น ๆ ภายใต้การกระทำของ DNA polymerase เป็นผลพลอยได้ทั่วไปของ PCR และบางครั้งก็กลายเป็นผลิตภัณฑ์หลัก

นอกจากนี้ ให้หลีกเลี่ยงลำดับที่คล้ายคลึงกันระหว่างไพรเมอร์ทั้งสอง โดยเฉพาะอย่างยิ่งชิ้นส่วนโอลิโกนิวคลีโอไทด์ที่มีเบสเหมือนกันมากกว่า 6 เบสติดต่อกัน มิฉะนั้นไพรเมอร์ทั้งสองจะแข่งขันกันสำหรับไซต์เดียวกันของเทมเพลต ในทำนองเดียวกันไพรเมอร์และ DNA เป้าหมายที่จะขยาย หรือลำดับอื่นๆ ของ DNA ตัวอย่างไม่สามารถมีลำดับที่คล้ายคลึงกันมากกว่า 6 เบส มิฉะนั้น ไพรเมอร์จะจับกับบริเวณอื่นๆ ซึ่งจะช่วยลดการขยายสัญญาณเฉพาะและเพิ่มการขยายแบบไม่เฉพาะเจาะจง

5. ไพรเมอร์ 3'สิ้นสุดการจับคู่ DNA polymerase เพิ่มนิวคลีโอไทด์เดี่ยวให้กับ 3' สิ้นสุดไพรเมอร์ ดังนั้นข้อกำหนดการจับคู่ของเบส 5-6 จาก 3'ส่วนท้ายของไพรเมอร์และ DNA เป้าหมายจะต้องแม่นยำและเข้มงวดเพื่อให้แน่ใจว่าการขยาย PCR มีประสิทธิภาพ .

การออกแบบไพรเมอร์มีความสมเหตุสมผลหรือไม่ สามารถตรวจสอบได้โดยการค้นหาด้วยคอมพิวเตอร์โดยใช้ซอฟต์แวร์ PCRDESN และซอฟต์แวร์ American PRIMER

โอลิโกนิวคลีโอไทด์ที่สังเคราะห์อย่างพึงประสงค์ควรถูกทำให้บริสุทธิ์โดยโครมาโตกราฟี (โครมาโตกราฟี) หรือ PAGE เพื่อขจัดสิ่งเจือปน เช่น สายสั้นที่ยังไม่ได้สังเคราะห์จนถึงความยาวเต็มที่ ไพรเมอร์บริสุทธิ์ที่เก็บไว้ในสารละลายอะซิโตไนไทรล์ 25% ที่อุณหภูมิ 4°C สามารถป้องกันจุลินทรีย์ได้ ภายใต้สถานการณ์ปกติ ควรเก็บไพรเมอร์ที่ไม่ได้ใช้ไว้ในตู้เย็นที่อุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียส ไพรเมอร์สามารถเก็บไว้ในของเหลวได้นาน 6 เดือน และสามารถเก็บไว้ได้ 1 ถึง 2 ปีหลังจากการทำให้แห้งด้วยความเย็น