ขั้นตอนการเพาะเลี้ยงเซลล์ในห้องปฏิบัติการ

1. การกู้คืนเซลล์

หลังจากที่เซลล์ที่เก็บรักษาด้วยการแช่เย็นถูกกำจัดออกจากไนโตรเจนเหลว พวกมันจะถูกละลายด้วยการเขย่าอย่างต่อเนื่องในอ่างน้ำที่มีอุณหภูมิ 37 องศา ย้ายเซลล์ที่ละลายแล้วลงในหลอดปั่นแยก เติม DMEM สมบูรณ์ที่อุ่นไว้ล่วงหน้าที่อุณหภูมิ 37 องศา (ซึ่งซีรั่มของทารกในครรภ์มีค่าประมาณ 10 เปอร์เซ็นต์ ) ค่อยๆ เป่าอย่างสม่ำเสมอ หมุนเหวี่ยงที่ 500 กรัมเป็นเวลา 2 นาที และทิ้งส่วนเหนือตะกอน

เติม DMEM ขนาดกลางที่สมบูรณ์เพื่อล้างและทิ้งส่วนเหนือตะกอน เติมอาหารเลี้ยงเชื้อ DMEM ผสมอย่างเบามือด้วยการปิเปต ทำสารแขวนลอยในเซลล์ เพาะเชื้อในจานเพาะเชื้อ/ขวดแก้ว และเพาะเลี้ยงในตู้เพาะเซลล์ที่มี CO2 5 เปอร์เซ็นต์

2. ทางผ่านของเซลล์

เมื่อความหนาแน่นของเซลล์ถึง 80 เปอร์เซ็นต์ ~ 90 เปอร์เซ็นต์ (ผลผลิตก่อนกำหนดไม่เพียงพอ เซลล์ที่สายเกินไปอยู่ในสภาพไม่ดี การเพาะเลี้ยงย่อยในอัตราส่วน 1:2 ถึง 1:10 หรือมากกว่า โดยทั่วไปการสร้างเซลล์ 1:3 ถึง 1:5 นั่นคือจากการเพาะเลี้ยงเซลล์ ในช่วงเวลาของการแยกและการเพาะเลี้ยงใหม่ อาหารเลี้ยงเชื้อทั้งหมดจะถูกเอาออกและล้างสองครั้งด้วย 1X PBS

เพิ่มทริปซิน (หมายเหตุ: ปริมาณของสารละลายในการย่อยที่ดีที่สุดเพื่อให้ครอบคลุมเซลล์ และอุณหภูมิในการย่อยที่เหมาะสมคือ 37 องศา สังเกตเซลล์ภายใต้กล้องจุลทรรศน์: สังเกตเซลล์ที่ถูกย่อยภายใต้กล้องจุลทรรศน์แบบกลับ ถ้าไซโตพลาสซึมหดกลับ เซลล์ ไม่เชื่อมต่อกันอีกต่อไป หั่นเป็นชิ้น ๆ ซึ่งแสดงว่าเซลล์ได้รับการย่อยอย่างเหมาะสมแล้วในขณะนี้) ย่อยเซลล์เหล่านั้น และวางไว้ในตู้ฟักไข่เป็นเวลาประมาณ 2-3 นาที

เติมตัวกลางสมบูรณ์ DMEM ในปริมาณที่เหมาะสมเพื่อหยุดทริปซิไนเซชัน ถ่ายโอนไปยังหลอดปั่นแยกและหมุนเหวี่ยงที่ 500 กรัมเป็นเวลา 2 นาที ทิ้งส่วนลอย เติมตัวกลางสมบูรณ์ DMEM เพื่อล้าง และทิ้งส่วนเหนือตะกอน

เติมอาหารเลี้ยงเชื้อ DMEM ผสมโดยการปิเปตอย่างเบามือ ปิเปต 10 ไมโครลิตรเพื่อนับ จากนั้นเพาะเลี้ยงต่อในตู้เพาะเลี้ยงเซลล์ที่มี CO2 ร้อยละ 5 ตามปริมาตรเซลล์ที่ต้องการ

3. การเก็บรักษาเซลล์ด้วยความเย็น

เมื่อความหนาแน่นของเซลล์ถึง 80 เปอร์เซ็นต์ ~90 เปอร์เซ็นต์ ให้นำสื่อทั้งหมดออกและล้าง 2 ครั้งด้วย 1X PBS เติมทริปซินสำหรับการย่อยและวางไว้ในตู้ฟักไข่ประมาณ 2-3 นาที เติม DMEM complete medium เพื่อหยุดการย่อยของทริปซิน ถ่ายโอนไปยัง centrifuge tube และ centrifuge ที่ 500 g เป็นเวลา 2 นาที ทิ้ง supernatant เติม DMEM complete medium เพื่อล้าง และทิ้ง supernatant เติมสารละลายแช่แข็ง 1 มล. (ซีรั่มวัวทารกในครรภ์ 90 เปอร์เซ็นต์, DMSO 10 เปอร์เซ็นต์ โดยทั่วไปแล้ว ปริมาณซีรั่มสามารถปรับได้ระหว่าง 10 เปอร์เซ็นต์ถึง 90 เปอร์เซ็นต์ การเพิ่มซีรั่มลงในสารละลายเยือกแข็งสามารถให้สารอาหารสำหรับเซลล์ในแง่หนึ่ง และสามารถ ให้สารป้องกันที่ไม่ซึมผ่านระหว่างการเก็บรักษาด้วยความเย็นของเซลล์ เช่น ซูโครส อัลบูมิน เป็นต้น เพื่อป้องกันเซลล์ได้ดีขึ้น) ใส่ลงในหลอดถนอมอาหารด้วยความเย็น (มีไอโซโพรพิลแอลกอฮอล์ในหลอดเพื่อให้อุณหภูมิลดลงอย่างรวดเร็ว) ใส่ทันที แช่แข็งในตู้เย็น 4 องศาเป็นเวลา 30 นาที จากนั้นวางไว้ในตู้เย็น -20 องศาเป็นเวลา 30 นาที จากนั้นแช่ไว้ในตู้เย็น -80 องศาค้างคืน

ใส่ในไนโตรเจนเหลวในวันถัดไป สามารถเก็บไว้ได้อย่างน้อยสองปี และถ้าคุณไม่ใส่ในไนโตรเจนเหลว ก็สามารถเก็บไว้ได้สามเดือน

หลักการของการเก็บรักษาและการคืนสภาพของเซลล์ด้วยการแช่แข็งคือ: การแช่แข็งและการละลายอย่างช้าๆ ซึ่งเอื้อต่อการรักษาความมีชีวิตของเซลล์ การเก็บรักษาเซลล์ด้วยความเย็นโดยไม่ใช้สารป้องกันใดๆ จะนำไปสู่การผลิตผลึกน้ำแข็งภายในเซลล์ ซึ่งจะทำให้เซลล์เสียหายเชิงกลภายในเซลล์ ทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงในสภาพแวดล้อมภายในเซลล์ แรงดันออสโมติก ค่า pH อิเล็กโทรไลต์ ฯลฯ และจากนั้นส่งเสริมการตายของเซลล์

4. เรื่องที่ต้องให้ความสนใจ

(1) อุ่นสารละลายเพาะเชื้อ: ใส่ขวดที่เตรียมไว้ซึ่งมีสารละลายเพาะเชื้อ, PBS และทริปซินลงในอ่างน้ำ 37 องศาเพื่ออุ่น

(2) ใช้แอลกอฮอล์ 75 เปอร์เซ็นต์เช็ดโต๊ะและมือที่สะอาดเป็นพิเศษซึ่งได้รับการฉายรังสีอัลตราไวโอเลต

(3) การจัดวางเครื่องมือที่ใช้แล้วให้ถูกต้อง: ตรวจสอบให้แน่ใจว่ามีพื้นที่ปฏิบัติงานเพียงพอ ซึ่งไม่เพียงแต่ใช้งานง่าย แต่ยังช่วยลดมลพิษด้วย

(4) จุดตะเกียงแอลกอฮอล์: โปรดทราบว่าเปลวไฟไม่ควรเล็กเกินไป

(5) การดำเนินการปลอดเชื้ออย่างเข้มงวด

(6) การย่อยของเซลล์สานุศิษย์ในระดับปานกลาง: เวลาในการย่อยขึ้นอยู่กับปัจจัยหลายอย่าง เช่น ประเภทของสารละลายย่อย เวลาในการเตรียม และปริมาณที่เติมลงในขวดเพาะเลี้ยง ในระหว่างกระบวนการย่อยอาหาร ควรให้ความสนใจกับการเปลี่ยนแปลงรูปร่างของเซลล์เพาะเลี้ยง เมื่อไซโตพลาสซึมหดตัว หากการเชื่อมต่อหลวมหรือมีสัญญาณของการลอยเป็นชิ้น ๆ ควรยุติการย่อยทันที

(7) การทำงานทั้งหมดบนเซลล์ทางเดินควรอยู่ใกล้เปลวไฟของตะเกียงแอลกอฮอล์มากที่สุดเท่าที่จะเป็นไปได้ เป็นการดีที่สุดที่จะทำงานกับเซลล์เดียวต่อครั้ง โดยใช้อุปกรณ์หนึ่งชุดสำหรับแต่ละเซลล์ หลีกเลี่ยงการติดเชื้อข้าม;

(8) ปากขวดของเซลล์ที่ผ่านจะต้องได้รับการฆ่าเชื้อด้วยตะเกียงแอลกอฮอล์ทุกครั้งที่เปิดหรือปิด