เมื่อคุณเพิ่งจบการศึกษาและเข้าทำงาน คุณจะพบคำนามมากมายที่ต้องเผชิญกับการทดลอง PCR เชิงปริมาณแบบเรียลไทม์ คุณสับสนเกี่ยวกับจุดเริ่มต้น? ความหมายของเส้นโค้งการขยาย, เส้นโค้งมาตรฐาน, เกณฑ์, ค่า CT, เส้นโค้งการหลอมเหลวและเส้นฐานคืออะไร? ภาพเรืองแสงจากการทดลองเหล่านั้นสว่างเกินไป แต่ฉันไม่สามารถระบุได้ วันนี้เราจะพาคุณมาเรียนรู้ความรู้และแนวคิดเหล่านี้ใน 2 ส่วน ได้แก่ คำศัพท์ทางเทคนิคและคำถามที่พบบ่อย
ส่วนที่ 1 ข้อกำหนดด้านวิชาชีพ
1. เส้นโค้งการขยาย
เส้นโค้งการขยายหมายถึงเส้นโค้งที่หมายเลขรอบคือ abscissa และความเข้มของฟลูออเรสเซนตามเวลาจริงระหว่างปฏิกิริยาคือค่าที่กำหนดระหว่าง PCR
2. พื้นฐาน
ค่าพื้นฐานหมายถึงการเปลี่ยนแปลงเพียงเล็กน้อยในสัญญาณเรืองแสงในช่วงสองสามรอบแรกของปฏิกิริยาการขยายสัญญาณ PCR ระดับสัญญาณจะแสดงใกล้กับเส้นตรงซึ่งเป็นเส้นฐาน
3. การตั้งค่าเกณฑ์การเรืองแสง
โดยทั่วไป สัญญาณการเรืองแสงของ 15 รอบแรกของปฏิกิริยา PCR จะใช้เป็นสัญญาณพื้นหลังของการเรืองแสง และเกณฑ์การเรืองแสงคือ 10 เท่าของค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานของสัญญาณการเรืองแสงระหว่าง 3-15 รอบของ PCR และเกณฑ์การเรืองแสง ถูกตั้งค่าระหว่างเฟสเอ็กซ์โปเนนเชียลของการขยาย PCR โดยปกติแล้ว อุปกรณ์แต่ละชิ้นจะมีเกณฑ์การเรืองแสงก่อนใช้งาน
4. ค่า CT
ค่า CT แสดงถึงจำนวนรอบที่จะเกิดขึ้นสำหรับแต่ละหลอดปฏิกิริยา PCR เมื่อสัญญาณเรืองแสงถึงเกณฑ์ที่ตั้งไว้ จากการวิจัย เราทราบว่ามีความสัมพันธ์เชิงเส้นตรงระหว่างค่า CT ของแต่ละแม่แบบและลอการิทึมของหมายเลขสำเนาเริ่มต้นของแม่แบบนั้น ยิ่งจำนวนสำเนาเริ่มต้นสูง ค่า CT ก็จะยิ่งน้อยลงเท่านั้น และในทางกลับกัน เมื่อใช้มาตรฐานกับหมายเลขสำเนาเริ่มต้นที่รู้จัก เส้นโค้งการสอบเทียบสามารถทำได้โดยที่ abscissa แทนลอการิทึมของหมายเลขสำเนาเริ่มต้น ในขณะที่ลำดับแสดงถึงค่า CT ดังนั้น ตราบเท่าที่ได้รับค่า CT ของตัวอย่างที่ไม่รู้จัก หมายเลขสำเนาเริ่มต้นของตัวอย่างสามารถคำนวณได้จากเส้นโค้งมาตรฐาน
รู้เพิ่มเติม
มีตัวบ่งชี้หลายอย่างที่จะตัดสินว่ากราฟการขยายสัญญาณนั้นดีหรือไม่:
คำตอบ: จุดเปลี่ยนของเส้นโค้งนั้นชัดเจน โดยเฉพาะอย่างยิ่งเฟสเอ็กซ์โพเนนเชียลของตัวอย่างเศษส่วนที่หนักต่ำนั้นชัดเจน ความขนานโดยรวมของเส้นโค้งการขยายสัญญาณนั้นดีมาก เส้นฐานเรียบ ไม่มีปรากฏการณ์ที่เพิ่มขึ้น และการขยาย เส้นโค้งของตัวอย่างความเข้มข้นของเฟสเอกซ์โปเนนเชียลในระดับต่ำนั้นดีมาก ชัดเจน.
B: ความชันของเฟสเอกซ์โพเนนเชียลของเส้นโค้งเป็นสัดส่วนโดยตรงกับประสิทธิภาพการขยาย ยิ่งมีความชันมาก ประสิทธิภาพการขยายยิ่งสูงขึ้น
C: เส้นฐานมาตรฐานทรงตัวหรือลดลงเล็กน้อย โดยไม่มีแนวโน้มขาขึ้นที่ชัดเจน
D: ความขนานของเส้นโค้งการขยายสำหรับแต่ละหลอดนั้นดี ซึ่งบ่งชี้ว่าประสิทธิภาพการขยายของหลอดปฏิกิริยาแต่ละหลอดนั้นใกล้เคียงกัน
5. เส้นโค้งการหลอมละลาย
เมื่อผลิตภัณฑ์ PCR ได้รับความร้อน เมื่ออุณหภูมิสูงขึ้น ผลิตภัณฑ์ขยายสัญญาณแบบเกลียวคู่จะค่อยๆ แยกตัวออกจากกัน ส่งผลให้ความเข้มของการเรืองแสงลดลง เมื่อถึงอุณหภูมิที่กำหนด ผลิตภัณฑ์จำนวนมากจะแยกออกจากกัน ส่งผลให้การเรืองแสงลดลงอย่างรวดเร็ว การใช้ฟังก์ชันนี้ร่วมกับค่า TM ที่แตกต่างกันสำหรับผลิตภัณฑ์ PCR ที่แตกต่างกันยังทำให้อุณหภูมิที่สัญญาณเรืองแสงลดลงอย่างรวดเร็วแตกต่างกันอีกด้วย ซึ่งอาจเป็นวิธีที่ดีในการระบุความจำเพาะของ PCR
6. เส้นโค้งการหลอมละลาย (ใช้เส้นโค้งลอการิทึม)
กราฟจุดสูงสุดเกิดจากลอการิทึมของเส้นโค้งการหลอมเหลวเพื่อแสดงสถานการณ์ของชิ้นส่วนผลิตภัณฑ์ได้ง่ายยิ่งขึ้น เนื่องจากอุณหภูมิหลอมเหลวคือค่า TM ของชิ้นส่วน DNA จึงสามารถกำหนดพารามิเตอร์บางอย่างที่ส่งผลต่อค่า TM ของชิ้นส่วน DNA ได้ เช่น ขนาดชิ้นส่วน ปริมาณ GC เป็นต้น โดยทั่วไปแล้ว ตามหลักการออกแบบไพรเมอร์ของเรา มักจะกล่าวว่า ความยาวของผลิตภัณฑ์ขยายอยู่ในช่วง 80-300bp และอุณหภูมิหลอมเหลวควรอยู่ระหว่าง 80 องศาถึง 90 องศา
ตอบ: หากมีเพียงหนึ่งพีคหลักระหว่าง 80 องศาและ 90 องศา แสดงว่า PCR แบบเรียลไทม์นั้นสมบูรณ์แบบ
B: ถ้าพีคหลักปรากฏขึ้นระหว่าง 80 องศาถึง 90 องศา และพีคสิ่งเจือปนปรากฏต่ำกว่า 80 องศา โดยทั่วไปจะพิจารณาไพรเมอร์-ไดเมอร์ นี่เป็นทางเลือกที่ดีในการพยายามแก้ไขโดยการเพิ่มอุณหภูมิการหลอม
C: ถ้ายอดหลักปรากฏขึ้นระหว่าง 80 องศาถึง 90 องศา และยอดที่พเนจรปรากฏขึ้นเมื่ออุณหภูมิเพิ่มขึ้น จะถือว่ามีการปนเปื้อนของ DNA โดยพื้นฐานแล้ว และจำเป็นต้องถอด DNA ออกในระยะเริ่มต้นของการทดลอง
7. เส้นโค้งมาตรฐาน
มาตรฐานมาตรฐานถูกเจือจางให้มีความเข้มข้นต่างกันและใช้เป็นแม่แบบสำหรับปฏิกิริยา PCR เส้นโค้งมาตรฐานถูกลงจุดด้วยลอการิทึมของหมายเลขสำเนามาตรฐานเป็น abscissa และค่า CT ที่วัดได้เป็นลำดับ เมื่อหาปริมาณตัวอย่างที่ไม่รู้จัก สามารถรับหมายเลขสำเนาของตัวอย่างได้จากเส้นโค้งมาตรฐานตามค่า CT ของตัวอย่างที่ไม่รู้จัก เส้นโค้งมาตรฐานมีความสำคัญมากสำหรับการหาปริมาณสัมบูรณ์
ส่วนที่สอง ปัญหาที่พบบ่อย
คำถามที่ 1: อะไรคือความแตกต่างระหว่าง RT-PCR, QPCR, real-time PCR และ real-time RT-PCR?
A1: RT-PCR คือ PCR การถอดความแบบย้อนกลับ ซึ่งเป็นตัวแปรของปฏิกิริยาลูกโซ่โพลิเมอเรสที่ใช้กันอย่างแพร่หลาย ใน RT-PCR สาย RNA จะถูกแปลงกลับเป็น DNA เสริม ซึ่งจากนั้นจะใช้เป็นแม่แบบสำหรับ PCR เพื่อขยาย DNA โดย PCR
PCR แบบเรียลไทม์และ QPCR เป็นสิ่งเดียวกัน ทั้งคู่เป็น PCR เชิงปริมาณตามเวลาจริง ซึ่งหมายความว่ามีการบันทึกข้อมูลแบบเรียลไทม์ในแต่ละรอบระหว่างกระบวนการ PCR ด้วยวิธีนี้ จึงสามารถวิเคราะห์จำนวนเทมเพลตเริ่มต้นได้อย่างแม่นยำ
แม้ว่าทั้ง PCR แบบเรียลไทม์และ PCR แบบถอดความแบบย้อนกลับดูเหมือนจะเรียกโดยย่อว่า RT-PCR แต่อนุสัญญาระหว่างประเทศระบุว่า RT-PCR หมายถึง PCR แบบถอดความแบบย้อนกลับโดยเฉพาะ ในขณะที่ PCR แบบเรียลไทม์มักจะย่อเป็น qPCR (Quantitative Real- ทรู เรียล-ทรู เรียล พีซีอาร์ ) - ไทม์ พีซีอาร์)
RT-PCR แบบเรียลไทม์ (RT-QPCR) คือ PCR การถอดความแบบย้อนกลับประเภทหนึ่งที่รวมเทคนิคเชิงปริมาณเรืองแสง: การถอดความแบบย้อนกลับครั้งแรกจาก RNA เพื่อรับ cDNA (RT) ตามด้วยการวิเคราะห์เชิงปริมาณโดยใช้ PCR แบบเรียลไทม์ (QPCR)
Q2: เหตุใดความยาวของชิ้นส่วนผลิตภัณฑ์ขยายของ PCR เชิงปริมาณเรืองแสงจึงถูกควบคุมภายในช่วง 80-300bp
A2: ความยาวของลำดับยีนแต่ละลำดับจะแตกต่างกัน บางตัวมีหลาย Kb และ BP หลายร้อยตัว อย่างไรก็ตาม เมื่อเราออกแบบไพรเมอร์ เราจำเป็นต้องกำหนดให้ผลิตภัณฑ์มีความยาว 80-300bp เท่านั้น และสั้นหรือยาวเกินไปไม่เหมาะสำหรับการตรวจจับ PCR เชิงปริมาณ
ชิ้นส่วนของผลิตภัณฑ์สั้นเกินไปที่จะแยกความแตกต่างจากไพรเมอร์-ไดเมอร์ ความยาวของไพรเมอร์-ไดเมอร์อยู่ที่ประมาณ 30-40bp เมื่อน้อยกว่า 80bp จะเป็นการยากที่จะแยกแยะว่าเป็นไพรเมอร์-ไดเมอร์หรือผลิตภัณฑ์ หากชิ้นส่วนของผลิตภัณฑ์ยาวเกินไป เกิน 300bp จะทำให้ประสิทธิภาพการขยายต่ำและไม่สามารถตรวจจับปริมาณของยีนได้อย่างมีประสิทธิภาพ
ตัวอย่างเช่น เมื่อคุณนับจำนวนคนในห้องเรียน คุณต้องนับจำนวนปากเท่านั้น เช่นเดียวกับการทดสอบยีน คุณจำเป็นต้องตรวจหาลำดับของยีนบางลำดับเท่านั้นจึงจะแสดงถึงลำดับทั้งหมดได้ เป็นเรื่องง่ายที่จะผิดพลาดหากคุณนับทั้งปากและจมูก หู และแว่นตาเพื่อนับคน
Q3: ความยาวที่เหมาะสมที่สุดสำหรับการออกแบบไพรเมอร์คือเท่าใด
A3: โดยทั่วไปแล้ว ความยาวของไพรเมอร์ในช่วง 20-24bp นั้นดี แน่นอน เราต้องใส่ใจกับค่า TM ของสีรองพื้นเมื่อออกแบบสีรองพื้น เนื่องจากมีค่าเกี่ยวข้องกับอุณหภูมิการหลอมที่เหมาะสมที่สุด หลังจากการทดลองหลายครั้ง ได้รับการพิสูจน์แล้วว่า 60 องศาเป็นค่า TM ที่ดี อุณหภูมิการหลอมต่ำสามารถนำไปสู่การขยายที่ไม่เฉพาะเจาะจงได้อย่างง่ายดาย ในขณะที่อุณหภูมิการหลอมสูงมักจะทำให้ประสิทธิภาพการขยายต่ำ เส้นโค้งการขยายสูงสุดช่วงปลาย และค่า CT ที่ล่าช้า
คำถามที่ 4: ปริมาณตัวอย่างที่เก็บมีผลต่อผลการทดลองหรือไม่?
A4: ไม่ เห็นได้ชัดว่ายิ่งเก็บตัวอย่างได้มาก RNA ที่ถูกสกัดออกมาก็จะยิ่งมี cDNA มากขึ้น และชิ้นส่วนเป้าหมายก็จะยิ่งมีมากขึ้น สำหรับการหาปริมาณแบบสัมบูรณ์ จำเป็นต้องคำนวณหมายเลขสำเนาของชิ้นส่วนเป้าหมาย และจำนวนตัวอย่างที่รวบรวมได้จะส่งผลต่อผลการทดลองอย่างแน่นอน ตัวอย่างเช่นการตรวจหาไวรัสตับอักเสบซี HBV ในเลือดคือการตรวจหาปริมาณ HBV ในเลือดในปริมาณหนึ่ง (1 มล.)
สำหรับปริมาณสัมพัทธ์ที่ใช้โดยทั่วไปในการวิจัยทางวิทยาศาสตร์ จำนวนตัวอย่างไม่เกี่ยวข้องกับผลการทดลอง เนื่องจากปริมาณสัมพัทธ์หมายถึงการเปรียบเทียบระหว่างยีนเป้าหมายกับยีนอ้างอิง โปรดพิจารณาว่าพวกมันเป็นชิ้นส่วนต้นน้ำและปลายน้ำที่อยู่ในสายกรดนิวคลีอิกเดียวกัน หากขนาดตัวอย่างใหญ่ ทั้งยีนอ้างอิงและยีนเป้าหมายจะเพิ่มขึ้นในสัดส่วนที่เท่ากันในเวลาเดียวกัน ซึ่งไม่ส่งผลต่อผลลัพธ์
คำถามที่ 5: ประสิทธิภาพของรีเวิร์สทรานสคริปเทสจะส่งผลต่อผลการทดลองหรือไม่?
A5: เช่นเดียวกับด้านบน โปรดทราบว่าเราต้องการประสิทธิภาพ RT ที่สูงขึ้น แต่เราต้องการให้เอนไซม์ RT ค่อนข้างเสถียรและได้ผลลัพธ์ที่สม่ำเสมอ นี่จะเป็นการทดสอบความสามารถที่เหมาะสมของชุดการถอดความแบบย้อนกลับของบริษัทใหญ่ ๆ
คำถามที่ 6 ประสิทธิภาพของเอนไซม์ TAQ มีผลต่อผลการทดลองหรือไม่?
A6: ประสิทธิภาพของเอนไซม์ TAQ ค่อนข้างมาก โดยปกติแล้ว เอนไซม์ taq แบบ hot-start เป็นสิ่งจำเป็นและมีประสิทธิภาพค่อนข้างมาก สำหรับชุดวัดปริมาณฟลูออเรสเซนซ์เชิงพาณิชย์ ผู้ผลิตแต่ละรายจะปรับประสิทธิภาพของสถานะที่ดีที่สุดตามผลิตภัณฑ์ของตนเองให้ใกล้เคียง 100 เปอร์เซ็นต์ หากประสิทธิภาพต่ำเกินไป ก็จะไม่สามารถรับผลการทดลองได้ สำหรับผลิตภัณฑ์ของบริษัทต่างๆ นี่เป็นตัวชี้วัดคุณภาพ
คำถามที่ 7 ปริมาณสีย้อมเรืองแสงมีผลต่อผลการทดลองหรือไม่?
A7: ใช่ มันจะ หากฟลูออโรโครมอิ่มตัวเกินไป อาจทำให้เกิดเสียงรบกวนในเครื่องดนตรีบางชนิดได้ หากฟลูออโรโครมไม่อิ่มตัวและค่าการเรืองแสงต่ำเกินไป จะเข้าสู่ช่วงที่ราบสูงก่อนกำหนดและเส้นโค้งการขยายจะแบน ในการทดลองเชิงปริมาณของฟลูออเรสเซนซ์ ส่วนใหญ่จะเห็นค่า CT ดังนั้นจึงไม่สำคัญสำหรับเส้นโค้งการขยายช่วงท้ายที่จะเข้าสู่ระยะที่ราบสูง แต่ภาพไม่สวยพอ หากคุณต้องเลือก ให้เริ่มจากการเลือกฟลูออโรโครมที่มีความอิ่มตัวน้อยกว่าเล็กน้อย อย่างไรก็ตาม เมื่อใช้ผลิตภัณฑ์เดียวกันจากบริษัทเดียวกัน
คำถามที่ 8 การส่ง PCR tube จะมีผลกับผลการทดลองหรือไม่?
A8: ใช่ อย่างไรก็ตาม สำหรับวัสดุสิ้นเปลืองชุดเดียวกันจากผู้ผลิตรายเดียวกัน สามารถละเว้นผลกระทบนี้ได้ นี่เป็นทางเลือกที่ดีและควรใช้แผ่น 96-หลุมที่มีเมมเบรนซึมผ่านได้สูงเพื่อลดผลกระทบจากการส่องผ่านของแสงของวัสดุสิ้นเปลือง
Q9: ข้อผิดพลาดระหว่างการทำงานจะส่งผลต่อผลการทดลองหรือไม่?
A9: อิทธิพลของกระบวนการปฏิบัติงานส่วนใหญ่สะท้อนให้เห็นในความสม่ำเสมอ ความเป็นเนื้อเดียวกันหมายความว่าส่วนประกอบทั้งหมดในระบบผสมกันเท่าๆ กัน และการหมุนเหวี่ยงด้วยแฟลชสามารถแก้ปัญหานี้ได้ นอกจากนี้ สำหรับผู้เริ่มต้น ควรปรับระบบ PCR ให้มากกว่า 20 นิ้ว และระบบที่เล็กเกินไปมีแนวโน้มที่จะเกิดข้อผิดพลาดได้ง่ายกว่า หากปรับอุณหภูมิการหลอมให้เหมาะสม ผลกระทบของความเข้มข้นของไพรเมอร์ต่อ CT จะลดลง และคุณจะรู้ว่าข้อผิดพลาดในการทำงานบางอย่าง (เช่น ความเข้มข้นของไพรเมอร์) สามารถหลีกเลี่ยงได้โดยการปรับอุณหภูมิการหลอมให้เหมาะสม
สรุป
ข้างต้นเป็นคำถามและคำถามที่ผู้เริ่มต้นมักพบในระหว่างการทดสอบ เราหวังว่าคำถามเหล่านี้จะช่วยคุณไขความสับสนได้ การทดลองคือกระบวนการสร้างความสับสนวุ่นวายและการแก้ปัญหา หวังว่าคุณจะได้บางอย่างจากมัน ขอบคุณสำหรับการอ่านและเราจะพบคุณในครั้งต่อไป!
